12-14 декабря 2018, Москва, ул. Академика Опарина, 4
Тезисы 2018
Молекулярно-генетические девиации и акушерская патология
Авторы: Кудрявцева Е.В., Ковалев В.В.
Организация: Уральский государственный медицинский университет
В развитии осложнений беременности существует генетический компонент, о чем свидетельствуют исследования наследуемости, анализ популяционных баз данных, генетический семейный анализ. Раскрытие генетических механизмов формирования акушерской патологии теоретически может позволить разработать методы патогенетической профилактики осложнений беременности еще на этапе преконцепционной подготовки, что в свою очередь должно способствовать снижению перинатальной и младенческой заболеваемости и смертности. «Большие акушерские синдромы» имеют общие механизмы. Основные из них это патология сосудов, нарушение гемостаза, извращение иммунного ответа (воспаление), эндокринные нарушения и неустойчивость к воздействию неблагоприятных токсических факторов окружающей среды. Все эти процессы генетически детерминированы, и это имеется ввиду при изучении генетической предрасположенности к большим акушерским синдромам. В докладе представлен краткий обзор ведущих генных систем ответственных за вероятные механизмы формирования «больших акушерских синдромов».
Опыт использования неинвазивного пренатального скрининга в России.
Авторы: Кудрявцева Е.В., Ковалев В.В.
Организация: Уральский государственный медицинский университет
В России НИПС используется уже в течение нескольких лет. Однако до 2017 года биологический материал для проведения исследования направлялся в лаборатории США и стран Европы. Лишь недавно появилась возможность проводить исследование в России. В нашем исследовании мы решили оценить результативность российского НИПС. Исследование проводилось на базе кафедры акушерства и гинекологии ФПК и ПП УГМУ и медико-генетического центра «Геномед». В исследование были включены пациентки, которые выполнили российский неинвазивный пренатальный скрининг (НИПС) в период 1.05.17 по 1.05.18. Мы убеждены, что необходимо более широкое использование НИПС в качестве теста первой линии, особенно у пациенток группы высокого риска по наличию хромосомных аномалий у плода. Использование российского НИПС предпочтительно, так как сокращает срок от момента сдачи анализа до получения результата, что особенно важно, если исследование проводится во 2 триместре.
Эпигенетические механизмы регуляции сперматогенеза.
Авторы: C.А Руднева С.А., В.Б. Черных.
Организация: ФБГУ «Медико-генетический научный центр»
Одним из главных достижений последних транскриптомных исследований является признание регуляторной роли длинных некодирующих РНК- lncRNAs в сперматогенезе. Технология РНК-Seq за последние несколько лет предоставила многочисленные открытые данные транскриптомов на разных стадиях сперматогенеза. Полученные данные могут быть повторно проанализированы и обобщены с использованием различных справочных баз данных, таких как: RefSeq, Ensembl, Noncode, fRNAdb. И полезных онлайн программ: http://deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/ показывает профили экспрессии lncRNA в разных тканях человека; http://starbase.sysu.edu.cn/ содержит информацию о lncRNA - микроРНК и lncRNA-белковых взаимодействиях; http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/ обеспечивает средство для прогнозирования возможного взаимодействия между lncRNA и белками. Используя обобщённые данные многочисленных транскриптомных исследований на разных стадиях сперматогенеза, приведены примеры того, какие регуляторные функции в данном процессе могут выполнять длинные некодирующие РНК. 1. lncRNAs могут образовывать комплексы c транскрипционными факторами и блокировать их взаимодействие с целевой ДНК. Пример: Tsx, Dmr, Mrhl. 2. lncRNAs могут активировать эпигенетические модификаторы, нацелив их на конкретные участки ДНК, изменяя метилирование ДНК и гистонные модификации- пример-XIST. 3. lncRNAs могут быть подвергнуты рестрикции такими РНКазами как Drosha и Dicer с образованием siРНК, которые в свою очередь могут осуществлять дальнейшую пост-транскрипционную регуляцию. Примеры: HongrES2, Mrhl, Tsx, Spga-lncRNA1 и 2.
Использование полноэкзомного секвенирования в ДНК-диагностике мужского бесплодия.
Авторы: Руднева С.А., Черных В.Б., Брагина Е.Е.
Организация: ФБГНУ «Медико-генетический научный центр»
Существует достаточно широкий ряд причин, ответственных за нарушения подвижности сперматозоидов, некоторые из которых можно откорректировать, в то время как другие, связанные с генетическими дефектами заслуживают полного обследования пациента для правильной постановки диагноза. Подвижность сперматозоидов зависит от нескольких метаболических путей и регуляторных механизмов. Помимо конкретных генных дефектов, любые нарушения в этих путях могут быть ответственны за случаи плохой подвижности сперматозоидов и как следствие стать причиной бесплодия. Нарушение подвижности сперматозоидов может быть обусловлено и дефектами строения и функций реснитчатого аппарата. Использование электронной микроскопии сперматозоидов позволяет обнаруживать различные аномалии ультраструктуры аксонемы и других компонентов жгутика (динеиновых ручек, радиальных спиц, центральных микротрубочек). В составе аксонемы и примыкающих к ней структур обнаружено более 250 различных белков. Описаны мутации генов, вызывающих нарушения в строении жгутиков сперматозоидов. Наиболее часто мутации затрагивают гены DNAI1 (14-16%) и DNAH5 (25-27%), кодирующих белки наружных динеиновых ручек аксонемы. Преимущества полноэкзомного секвенирования (ПЭС) заключаются в создании подходов в молекулярно-генетической диагностике на основе анализа всех возможных генов, в том числе недавно обнаруженных, от существующих в клинических (таргетных) генных панелях.
Влияние химических и мелкодисперсных поллютантов атмосферного воздуха на сперматогенез и параметры эякулята.
Авторы: Седова А.О., Курило Л.Ф., Черных В.Б.
Организация: ФГБНУ МГНЦ
В настоящее время проблемой бесплодия страдает около 15-20% супружеских пар, и с каждый годом проблема становится актуальнее. В половине случаев бесплодия причиной является патология мужской репродуктивной сферы. За последние десятилетия значительно ухудшилось количество и качество спермы, том числе сперматозоидов с нормальной подвижностью и морфологией. Рассмотрено влияние мелкодисперсных частиц: PM2,5 и PM10; газов: диоксид и оксид азота, оксид углерода, диоксид серы, озон; тяжелых металлов: свинец, кадмий на параметры репродуктивных органов и спермы. Эффекты воздействия химических и мелкодисперсных поллютантов атмосферного воздуха на состояние тестикул, сперматогенеза и показателей эякулята характеризуются: снижением концентрации, подвижности и жизнеспособности сперматозоидов; повышением фрагментации ДНК в половых клетках, увеличением продукции активных форм кислорода; повышением анеуплоидии в мужских гаметах. Кроме того на модельных животных негативными эффектами являлись: снижение веса семенников, дегенеративные изменения и атрофия семенных канальцев, угнетение сперматогенеза, повышение апоптотической активности герминативного эпителия, снижение уровня гормонов (ФСГ, ЛГ, тестостерон). Выявлено влияние загрязнения воздуха на фрагментацию ДНК и снижения параметров спермы и сперматозоидов, которые, в свою очередь, могут оказывать влияние на мужскую фертильность. Загрязнение атмосферного воздуха оказывает негативное влияние на сперматогенез, количество и качество сперматозоидов, может оказывать генотоксический эффект в хромосомных и генных мутациях, фрагментации ДНК.
Медико-генетическое обследование пациентов с синдромом CBAVD.
Авторы: Е.Г Марнат1, М.И. Штаут2, А.А. Адян1,2, А.В. Поляков2, В.Б.Черных1,2
Организация: 1 ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Россия; 2 ФГБУ «Медико-генетический нау
Синдром CBAVD в 80% случаев связан с мутациями в гене CFTR. У носителей мутации повышен риск рождения детей с муковисцидозом, поэтому для них актуально молекулярно-генетическое обследование на мутации в гене CFTR для прогнозирования здоровья будущего потомства. Цель работы: оценить частоту распространенных мутаций гена CFTR и охарактеризовать CFTR-генотипы у российских мужчин с синдромом CBAVD. Проведен ретроспективный анализ результатов молекулярно-генетического исследования у 60 неродственных российских мужчин с синдромом CBAVD, связанного с мутациями в гене CFTR. Мутации гена CFTR, в том числе 5Т аллель, обнаружены в 92 из 120 аллелей (76,6%). Мутации выявлены у 48 из 60 (80%) пациентов. Наиболее частыми из них являлись F508del; CFTRdele2,3(21kb) и W1282X, которые составили 54,2%, 12,5% и 8,3% от всех выявленных мутаций, соответственно. Аллель 5Т (вариант IVS8T5) обнаружен у 39 (65%) пациентов, в том числе у 4 мужчин в гомозиготном состоянии и у 35 пациентов в гетерозиготном состоянии с другим аллельным вариантом по данному полиморфизму (7Т или 9Т). Генотип, характеризующийся сочетанием мутации гена CFTR и 5Т- полиморфизма обнаружен у 27 (45%) обследованных. Для наиболее частой мутации F508del характерно сочетание с генотипом 5T/9T, либо 7Т/9Т. Полученные результаты свидетельствуют о схожести структуры генотипов по гену CFTR у российских мужчин с синдромом CBAVD с пациентами из других популяций. Наиболее частыми генотипами являлись «mutCFTR/5T» и «mutCFTR/N», которые суммарно составили 78,3% от всех генотипов. При наличии мутации и/или 5Т аллеля у мужчины необходимо обследовать супругу пациента на носительство мутаций до проведения процедур ВРТ, а при выявлении мутации рекомендовано проведение преимплантационной генетической диагностики.
Показатели спермограммы у мужчин с кариотипом 45,XY,der(13;14)(q10;q10).
Авторы: Андреева М.В., Сорокина Т.М., Курило Л.Ф., Черных В.Б.
Организация: ФГБНУ "Медико-генетический научный центр"
Введение: Хромосомные аномалии (ХА) являются одной из частых генетических причин бесплодия. Носители сбалансированных ХА имеют повышенный риск врожденных пороков развития у потомства, привычного невынашивания беременности и бесплодия. Сбалансированные ХА могут нарушать конъюгацию хромосом в мейозе и вызывать нарушения сперматогенеза. Наиболее распространенным их типом являются Робертсоновские транслокации (РТ) – транслокации между двумя акроцентрическими хромосомами, при которой происходит соединение их длинных плеч с утратой коротких плеч и одной центромеры. Центрическое слияние хромосом 13 и 14 является самым частым типом РТ. Методы: Обследовали 12 мужчин с бесплодием, имеющих кариотип 45,XY,der(13;14)(q10;q10). Спермиологическое исследование выполняли согласно рекомендациям ВОЗ (2010). Результаты: У всех пациентов обнаружена патозооспермия: у 2 (17%) – азооспермия, у 1 (8%) – криптозооспермия, у 8 – олигоастенотератозооспермия (67%), у 1 – астенотератозооспермия (8%). У 92% мужчин выявлены нормальные объем и рН эякулята. У одного пациента с азооспермией отмечена олигоспермия (V=1 мл) и повышенная кислотность эякулята (рН=6,5). Данному пациенту рекомендован анализ мутаций гена CFTR. У 5 из 9 мужчин, у которых в нативном эякуляте обнаружены сперматозоиды, их концентрация составила менее 1 млн/мл. У всех пациентов выявлено снижение подвижности сперматозоидов: от полного отсутствия прогрессивно подвижных сперматозоидов до нижней границы нормы. Выводы: У мужчин с бесплодием, носителей РТ (13;14) выявлено нарушение сперматогенеза, варьирующее от азооспермии до астенотератозооспермии и обуславливающее снижение фертильности. У 67% пациентов выявлены наиболее тяжелые формы патозооспермии: азооспермия, криптозооспермия и олигоастенотератозооспермия тяжелой степени.
Исследование митоза и мейоза в гонадах человека в пренатальный период.
Авторы: Штаут Мария Имреевна
Организация: ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», лаборатория генетики нарушений репродукции, Москва
Фертильность человека в значительной мере определяется состоянием гаметогенеза, количеством и качеством созревающих половых клеток (ПК). Важна роль патологии гаметогенеза в развитие нарушений репродукции, в том числе связанной с причинами бесплодия, однако динамика митотических и мейотических делений ПК в оогенезе и сперматогенезе изучена недостаточно. Препараты гонад эмбрионов и плодов (n=21) в исследовании получены после искусственного прерывания и спонтанного прекращения беременности в сроки от 6,5 до 34-х недель. При анализе состава гонад оценивали количество (%) и состояние ПК различных стадий (гонии, митозы, стадии мейоза) и соматических клеток. Согласно периодам антенатального развития человека и пола, исследованные образцы разделены на 5 групп: индифферентные гонады (n=5); гонады от эмбрионов и плодов женского пола до 18 недель (n=3) и с 18 недель после оплодотворения (начало фолликулообразования, n=4); мужские гонады 6-7,5 недель после оплодотворения (n=4); мужские гонады плодов старше 8 недель антенатального развития (n=5, извитые семенные канальцы окружены клетками мезенхимы). Пул женских ПК обеспечивается пролиферацией оогониев и дегенерацией части их ядер. В гонадах плодов мужского пола выявлены ПК в митозе, в дегенерации, на стадии прелептотенной конденсации хромосом. Важным отличием преобразования хроматина в мужских ПК является отсутствие этапа деконденсации хроматина в прелептотене профазы I мейоза. В оогенезе у человека профаза I происходит в пренатальный период, в сперматогенезе – с наступлением пубертата. Вступление некоторых мужских ПК на прелептотенную стадию отмечено в антенатальном периоде в мужских гонадах. Нарушения в гаметогенезе могут вызывать преждевременное инициирование мейоза, сопровождаться формированием двуядерных ПК.
Влияние стажа, должности и социо-демографических характеристик врачей на выбор метода пренатального скрининга: пилотное исследование в России.
Авторы: Ижевская В.Л., Жученко Л.А., Заяева Е.Е., Баранова Е.Е., Иванова Л.Ю.
Организация: ФГБНУ МГНЦ, ГБУЗ МО МОНИКИ, им. М.Ф. Владимирского, ФГБОУ ДПО РМАНПО МЗ РФ, ФГБУН ФНИСЦ РАН
Введение: НИПТ в сравнении с ранним комбинированным пренатальным скринингом позволяет выявлять синдром Дауна с большей степенью чувствительности и меньшим процентом ложноположительных результатов. Многие страны вводят НИПТ в систему общественного здравоохранения, однако в ходе мировых исследований было показано, что имеются различия в предпочтениях в выборе метода пренатального скрининга и сделан вывод, что для каждой страны необходимы свои руководства, разработанные с учетом социального контекста. Поэтому вопрос о внедрении НИПТ в рутинную практику должен решаться по результатам социологических исследований среди населения и врачей страны. Цель исследования: Определить влияние профессионального статуса и демографических характеристик врачей на выбор тестов пренатального скрининга для оценки связанных социальных и этических проблем, а также перспектив внедрения НИПТ в алгоритм массовой пренатальной диагностики. Методы исследования: Социологическое исследование, анкетирование. Результаты: В ходе исследования оценивалось влияние демографических показателей, стажа, должности и объема консультаций беременных на взгляды врачей, связанных с РПС, инвазивной диагностикой и НИПТ. Статистически значимым оказалось влияние возраста относительно целесообразности проведения НИПТ беременным только по синдрому Дауна. Также выдвинуто предположение, что более опытные врачи полагают, что на женщин оказывается большое социальное давление и ИПД должна проводиться вне зависимости от намерения семьи прервать беременность. Заключение: Требуется проведение дальнейших исследований для получения достоверных результатов и оценки влияния социальных и этических аспектов среди врачебного сообщества в России перед внедрением НИПТ в рутинную практику. Работа выполнена в рамках гранта РФФИ №18-013-01175.
Разработка и производство биомедицинских клеточных продуктов.
Авторы: Строкова С.О1., Арутюнян И.В1., Муллабаева С.М.1, Фатхудинов Т.Х.2
Организация: 1 ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России; 2 ФГА ОУВО «Российский университет дружбы народов»
Пупочный канатик является источником уникальных по своим свойствам мультипотентных стромальных клеток (МСК), однако доступ к нему открыт лишь в течение нескольких часов после рождения ребенка. Крупнейшие биобанки мира активно предлагают услуги криоконсервации ткани пуповины с целью выделения из неё аутогенных МСК при возникновении необходимости в будущем. Безопасность клеточных трансплантатов, включающая в себя и такой показатель, как стабильность генома клеток, во многом зависит от используемых протоколов криоконсервации и экспансии культур, при этом в большинстве протоколов криоконсервации используются ксеногенная сыворотка крови и потенциально токсичный диметилсульфоксид (ДМСО), а единый протокол оценки генетической стабильности МСК отсутствует.
Цель. Создание эффективного протокола криоконсервации ткани пуповины, отвечающего xeno-free и DMSO-free стандартам. Разработка протокола анализа генетической стабильности МСК, выделенных из криоконсервированной ткани пупочного канатика человека.
Материал и методы. Пуповину человека (n=23) получали при проведении родоразрешения путём операции кесарева сечения. Материал отмывали от крови, нарезали на диски толщиной 5 мм и помещали в криопротекторную среду. Использовали два типа криопротекторной среды: (1) эмбриональная телячья сыворотка с добавлением сахарозы до 0,5М и ДМСО до 10%, (2) фосфатно-солевой буфер рН 7,4 с добавлением сахарозы до 0,5М, глицерина до 20% и альбумина человека до 35 г/л. Материал охлаждали до -70°С со скоростью 1°С/мин. и переносили в криохранилище. Сравнение эффективности протоколов проводили через 1-2 недели хранения. Сохранность жизнеспособности клеток оценивали с помощью МТТ-теста на макропрепаратах и окрашивания кальцеином-АМ и иодидом пропидия на поперечных криосрезах. Выделение первичных клеточных культур проводили методом эксплантатов. Принадлежность выделенных культур к МСК оценивали с помощью анализа иммунофенотипа и индукции направленной дифференцировки in vitro. Оценка генетической стабильности проводилась классическим цитогенетическим методом с использованием GTG-окрашивания, GTG-бендинга.
Результаты. Оба используемых протокола криоконсервации обеспечивали сохранность архитектоники ткани пуповины после размораживания и выживаемость всех типов клеток: однослойного амниотического эпителия, стромальных клеток субамниотической, интерваскулярной и периваскулярной области, клеток стенок кровеносных сосудов и эндотелия. Эффективность выделения первичных клеточных культур из вартонова студня составила 100%. Клетки имели соответствующий МСК профиль экспрессии поверхностных антигенов CD73+, CD90+, CD105+, CD45-, CD34-, CD11b-, CD19-, HLA-DR- и отвечали на действие индукторов дифференцировки в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. В одной из культур, выделенной из криоконсервированной с использованием ДМСО ткани, на 4 пассаже были выявлены клетки с несбалансированным мужским кариотипом: добавочный материал на десятой хромосоме и инверсия первой хромосомы с точками разрыва 1p32 и 1q21. Дальнейшая экспансия данной культуры привела к повышению доли клеток с несбалансированным кариотипом с 53% на 4 пассаже до 75% на 12 пассаже.
Заключение. Разработанный протокол криоконсервации ткани пуповины человека без использования ксеногенных компонентов и ДМСО обеспечивает сохранность жизнеспособных клеток в ткани и возможность получения культуры мультипотентных стромальных клеток. Использование протоколов, соответствующих xeno-free и DMSO-free стандартам, необходимо для обеспечения качества полученных из криоконсервированной ткани клеточных культур, предназначенных для трансплантации. Оценка стабильности генома является одним из необходимых этапов оценки качества клеточного трансплантата.
Комментарии: Инициативная тема НИР РУДН № 030901-0-000.